以病毒为载体基因治疗药物研究进展
来源：罗兹曼国际转化医学研究院
近期，以病毒为载体的基因治疗药物频频夺目。FDA在5月批准诺华公司一次性治疗脊髓性肌萎缩的基因治疗药物Zolgensma 上市，价格达到令人咋舌的210万美元，成为史上最贵的药物。自2016年以来，欧洲药品管理局（EMA）和FDA共批准了6种基因治疗药物：2种用于B细胞癌的CAR-T细胞药物，以及β-地中海贫血、罕见视力丧失、脊髓性肌萎缩和罕见的原发性免疫缺陷等4种单基因疾病的药物。
基因治疗药物为常规方法无法治疗的疾病提供了希望。随着杜兴氏肌营养不良和亨廷顿氏病等800多项细胞和基因治疗项目的临床展开，将涌现出更多的基因治疗新药。本文编译自《新英格兰医学杂志》2019年8月1日题为《Gene Therapy》的综述。
基本原理
基因治疗遗传疾病的目的是改善或治愈疾病，不良事件少，持久表达治疗基因或转基因，主要有两种方案：1，整合载体导入前体细胞或干细胞，将基因传递给子细胞，载体能整合到患者染色体中的一个或多个位点；2，非整合载体中的基因传递到长期存活的终末分化或缓慢分裂的细胞，使功能基因在细胞生命过程中表达，治疗用DNA仅在染色体外稳定表达。
体内和体外转导
体外转导是从患者身上提取细胞并用靶基因转导，再将遗传修饰过的自体细胞经造血干细胞移植的方式回输给患者。体内基因传递与其它类型药物给药方式相同，冷冻保存携带基因的载体，在门诊进行解冻和制备使用。基因疗法治疗遗传病不仅需要鉴定病原基因，还要求转基因或蛋白产物必须到达生理相关的靶组织且稳定表达，不干扰细胞功能的完整性。
基因治疗体外递送示意图
（来源：新英格兰医学杂志）
基因治疗体内递送示意图
（来源：新英格兰医学杂志）
安全性
临床上已有相关风险数据。整合载体如逆转录病毒载体的主要风险是插入突变的，载体能插入到细胞DNA中并破坏基因的功能。体内给药载体的主要风险对载体的免疫反应。
体外基因治疗
重度联合免疫缺陷
2016年，EMA批准造血干细胞和祖细胞（HSPC）的体外基因治疗药物Strimvelis（Orchard Therapeutics公司）治疗腺苷脱氨酶重度联合免疫缺陷（SCID）。SCID患儿通常很早就死亡。该药是在γ-逆转录病毒载体中插入ADA功能基因拷贝，在体外修饰自体的HSPC，再将修饰过自体HSPC回输体内。
试验成功与否取决于移植前细胞减灭情况、低剂量白消安调节、高浓度的植入基因校正干细胞和中止酶替代治疗，以利于基因修饰细胞的扩增。但骨髓消融术所用的化疗有毒性，增加了继发肿瘤或骨髓衰竭的风险。目前正在研究抗体调节替代方案。
另一种早期方法是用γ-逆转录病毒载体使自体HSPC在体外表达编码普通γ链的IL2RG基因，移植回患者体内后恢复免疫功能。但部分参试者并发T细胞白血病，不得不做大剂量化疗和骨髓移植，继而转向使用更安全的慢病毒载体。慢病毒载体能在细胞周期静止期G0或G1期高效地转导造血细胞，基因组整合模式比γ-逆转录病毒载体更安全，但慢病毒载体的临床规模生产是难点。
因慢病毒载体转导效率高，基因修饰的HSPC已被用于治疗肾上腺脑白质营养不良和异染性白质营养不良，经基因校正的细胞迁移到大脑合成并分泌关键蛋白，被基因异常细胞吸收利用。但要达到再生干细胞中基因转移的治疗水平，需要完全骨髓消融术、高病毒拷贝数和转基因的超生理表达。
地中海贫血和镰状细胞贫血
珠蛋白基因表达调控复杂导致基因疗法治疗地中海贫血和镰状细胞性贫血进展缓慢。最近，β-地中海贫血患者干细胞基因治疗的I期和II期试验显示安全性不错，患者输血频率也有所降低。临床疗效与基因转移疗效、转导细胞病毒前体平均拷贝数、基因校正造血干细胞剂量正相关，与输血血红蛋白需求量负相关。
对编码βA-T87Q-珠蛋白突变基因载体的III期临床研究显示，有长达56个月的不输血期，促使EMA批准12岁及以上患者及无β0/β0基因型输血依赖性β-地中海贫血患者，做Zynteglo（Bluebird Bio公司）治疗。正在进行四项针对不同基因并使用不同载体治疗镰状细胞贫血的基因治疗的临床试验，分别为NCT03282656，NCT02247843，NCT02186418和NCT0215152。
体内基因治疗
体内基因转移研究是直接将载体注射到患者体内，目前大多数研究中都使用AAV载体治疗单基因疾病。重组AAV载体由一种无衣壳的非致病细小病毒工程化形成，在两个非编码病毒包装信号间加载由适当启动子驱动的治疗基因。AAV载体最主要的限制是如果基因序列长度超过5000碱基对，包装到载体中的效率就急剧下降。大多数AAV载体DNA稳定独立存在于细胞中，不整合到患者基因组，插入突变风险低。
注射高剂量AAV载体的新生小鼠有发生肝细胞癌风险,插入突变风险剂量依赖性增加，因为新生小鼠肝脏中快速的细胞分裂伴随着相对频繁的染色体断裂，是AAV载体整合的首选位点。临床研究中尚未观察到肝细胞癌，但在婴儿中使用AAV载体的经验有限，有必要持续监测。
由于多数人群早已暴露于野生型AAV，同时有AAV循环抗体和衣壳蛋白特异性记忆T细胞，因此以AAV为基础免疫反应是全身性治疗障碍。临床上采抗体来避免中和反应和控制细胞免疫反应。
2012年，EMA批准了首个AAV载体商用产品和基因治疗遗传病的基因药物alipogene tiparvovec（Glybera，uniqure），用于治疗罕见遗传性脂类疾病、脂蛋白脂酶缺乏症患者的复发或重症胰腺炎。由于该药物的商业性较差，该批准在2017年失效。
视力丧失
最近，AAV载体产品voretigene neparvovec-rzyl（Luxturna，Spark Therapeutics公司）获FDA和EMA批准，用于治疗RPE65基因突变引起的罕见常染色体隐性盲症，该基因编码对视觉周期至关重要的酶。AAV载体可在门诊手术中行神经视网膜下注射。
在自发RPE65缺陷犬模型中的研究中，实验犬经治疗恢复了视力，几个组的早期临床试验也有视力改善。上述研究是随机对照III期基因治疗临床试验的基础，接受药物治疗的患者视力功能性改善，全视野光敏感度和视野增强,4年随访表明疗效持久。但其它的I期II期试验效果短暂，载体注射后1年失效。目前正在进行各种遗传性视网膜营养不良的试验。
全身给药治疗血友病及其免疫反应
以肝脏或其它器官为靶点的AAV载体经静脉全身给药，在一些严重的遗传性疾病中有较好的临床效果。乙型血友病为凝血因子IX缺乏，cDNA全长约2800碱基对。AAV载体血管内给药有2个问题：20%~40%的成年人群中普遍存在的AAV抗体能中和载体，降低有效性；载体输注4~12周后对AAV衣壳出现迟发型细胞免疫反应，破坏转导细胞，治疗效果丧失。
第一个问题解决方式是排除已有抗体的患者。延迟型细胞免疫应答的临床表现是转氨酶水平的无症状自限性增加，伴随转基因的因子IX表达逐渐丧失。外周血单核细胞检测显示干扰素-γ的分泌响应了AAV衣壳肽，推测药物免疫抑制可能有治疗作用。因此转氨酶水平升高或因子IX水平降低的受试者接受糖皮质激素逐渐减少的疗程，6名接受最大剂量的受试者长期表达因子IX，3年观察期内出血事件和因子IX的使用均减少了90%。随后采用因子IX高特异性活性突变体使剂量仅为之前的1/4，因子IX平均活性水平更高，免疫应答频率更低。
甲型血友病为凝血因子VIII缺乏, cDNA全长9010碱基对。由于整合到AAV载体中的cDNA受长度限制，开展基因治疗甲型血友病的临床试验时间更长。临床试验使用编码因子Ⅷ截短的cDNA，9例患者中有7例接受最高剂量载体的男性，6例在20周时的因子Ⅷ活性水平介于12%~200%之间（正常50%~150%）；但超过3年随访显示，随时间推移，水平有所下降，但仍有效降低了2~3年内的年出血率。正在进行AAV载体介导的血友病基因转移的III期试验有NCT0337913、NCT03861273和NCT03569891。
脊髓性肌萎缩症
脊髓性肌萎缩是由编码生存运动神经元蛋白SMN1基因突变引起的疾病。根据发病年龄和严重程度，该病分为四种亚型。1型脊髓性肌萎缩是婴儿最常见的死亡遗传原因，平均死亡年龄为10.5个月，2周内每天至少16小时的机械通气。2016年，FDA批准使用反义寡核苷酸Nusinersen (Spinraza，Biogen公司）治疗该病，但需要鞘内反复给药。
2017年报道了15例1~8个月大的婴儿单次静脉注射表达SMN1 AAV9载体（onasemnogene abeparvovec-xioi, Zolgensma, AveXis公司）的结果，2019年获得FDA批准。初期试验中，全部15例患儿在20个月大时都为无呼吸机支持下存活，高剂量组的12例患儿中，11例无需辅助就坐，9例能翻身，11例能经口进食并说话；有两种4级不良反应，均为转氨酶水平升高，也是最常见的不良反应，为AAV载体全身给药所致，糖皮质激素治疗可缓解。试验扩大到100多例婴幼儿，印证了结果，但死亡2例，1例与潜在疾病的进展有关，另1例尸检结果悬而未决。
问题和展望
目前，监管机构的改革正在推动基因疗法。2018年，NIH和FDA联合宣布，基因治疗试验性新药将由FDA单独审查。同年， FDA发布了六份新纲要性指导文件，根据不断增长的基因治疗临床前、临床和生产等领域的经验和共识基础上，综合编纂了多种疾病靶点。
治疗费用可能阻碍基因治疗商业应用。对所有细胞和基因疗法来说，一次性的高价治疗是长期用药的补充，长期效益预期导致高成本有其合理性。目前血友病标准治疗是更换凝血因子，每年至少要40万美元。当前沿性基因疗法治疗以前无药物的疾病时，医疗保健系统直接不给予补偿，可依据疗效由药厂提供补偿，已在一些基因治疗药物上试行。只要疗效持续，就支付保险年金。
总之，基因治疗为迄今为止无法治愈的很多疾病找到了新治疗机会。但要攻克新药物所带来的挑战并充分发挥治疗潜力，还需要加大合作力度。
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